Vol. XXXII Issue 2
Article
DOI: 10.35407/bag.2021.32.02.04
RESEARCH
Aplicación de diferentes metodologías en el mejoramiento
de lenteja (Lens culinaris Medik)
Application of
different methodologies in lentil (Lens culinaris Medik) breeding
Bermejo
C.J.1
Maglia
F.1
Palacios
T.1
Espósito
M.A.1,2
Cazzola
F.1
Guindón
M.F.1
Gatti I.3
Cointry E.L.1 *
1 Instituto de
Investigaciones en Ciencias Agrarias de Rosario, Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Técnicas (IICAR-CONICET), Facultad de Ciencias Agrarias,
Universidad Nacional de Rosario (UNR), Zavalla, Argentina;
2 Instituto Nacional
de Tecnología Agropecuaria, EEA INTA Oliveros, Ruta Nacional 11 km 353, Oliveros,
Santa Fe.
3 CIUNR, Consejo de
Investigadores de la Universidad Nacional de Rosario, Rosario, Argentina;
* Corresponding author: Cointry, E. L. ecointry@unr.edu.ar
ORCID 0000-0001-5906-7291
General Editor: Elsa Camadro
RESUMEN
La
lenteja (Lens culinaris Medik.) es una especie diploide autógama (2n=2x=14)
perteneciente a la familia Fabaceae. Es uno de los cultivos más antiguos que se
conocen, con 8.000 a 9.000 años de historia, y se encuentra entre los primeros
domesticados en Medio Oriente. Las semillas tienen un alto valor nutricional.
Este cultivo es un interesante sustituto del trigo en las rotaciones de
cereales, pero su importancia es baja debido a la falta de buenas variedades
con adaptación local. Uno de los principales problemas que enfrentan los
mejoradores en nuestro país es la estrecha base genética del germoplasma
cultivado y su bajo potencial de rendimiento. En 2004 se inició un programa de
mejoramiento de lentejas para desarrollar nuevas variedades con adaptación a
las condiciones predominantes en las áreas de cultivo de Argentina. El
germoplasma se obtuvo del ICARDA (Centro Internacional de Investigación
Agrícola en las Zonas Áridas) y de productores locales. Se utilizan métodos
convencionales de mejoramiento basados en la hibridación y selección. Se han
obtenido dos nuevas variedades, una del tipo macrosperma (Boyerito FCA) y la
otra del tipo microsperma (Tacuarita FCA) mediante la aplicación de selección
masal en poblaciones F2 provenientes de la hibridación de materiales
seleccionados. Este programa complementa los métodos de mejora tradicional con
técnicas biotecnológicas como la transgénesis, el uso de marcadores
moleculares, el cultivo de embriones in vitro combinado con el método SSD para acortar
el ciclo generacional, y el fenotipado digital.
Palabras clave: Lenteja, Metodologías convencionales, Cultivo de embriones in vitro, Técnicas biotecnológicas,
Fenotipado digital
ABSTRACT
Lentil (Lens culinaris Medik.) is
a self-pollinating diploid (2n=2x=14) species belonging to the Fabaceae family.
It is one of the oldest crops known, with 8,000 to 9,000 years of history and
it is among the earliest domesticates from the Near East Fertile Crescent. The
seeds have high nutritional value. This crop is an interesting substitute to
wheat in cereal rotations but its importance is low due to a lack of suitable
varieties with local adaptation. Some of the major problems that Argentinian
lentil breeders face are the narrow genetic base of the current cultivated
germplasm and its low yield potential. A lentil breeding program was initiated
in 2004 to develop new varieties with adaptation to prevalent conditions in
growing areas of Argentina. Germplasm was obtained from ICARDA (International
Center for Agricultural Research in the Dry Areas) and local producers.
Conventional breeding methods using hybridization and selection are being
carried out to develop improved varieties, broad the genetic base, and isolate
superior recombinant inbred lines. Two new varieties have been obtained, one of
the macrosperm type (Boyerito FCA) and the other of the microsperm type
(Tacuarita FCA) through the application of mass selection in F2 populations
from the cross of selected materials. This program complements traditional
breeding methods with biotechnological techniques such as transgenesis, use of
molecular markers, in vitro embryo culture combined with the SSD method to
shorten the breeding time, and digital phenotyping.
Key words: Lentil,
Conventional methodologies, In vitro
embryo culture, Biotechnology techniques, Digital phenotyping
Received: 10/21/2020
Accepted: 11/04/2020
ORIGEN Y CLASIFICACIÓN
La
lenteja es un cultivo muy importante desde el comienzo de la revolución de la
agricultura en el Viejo Mundo y uno de los primeros en ser domesticados junto
al trigo, la cebada, la arveja y el lino (Zohary, 1976). Se lo considera
como uno de los cultivos más antiguos con unos 8000 a 9000 años de antigüedad (McVicar
et al., 2005).
Los restos más antiguos se han encontrado en las cuevas de Franchthi, Grecia,
datados en 11000 AC (Helbaek, 1963). En Tell Mureybit (Siria) fueron hallados
restos de semilla pequeña (2-3mm), datados entre 8500-7500 AC (Van
Zeist y Bottema, 1971;
Zohary, 1972; Hansen y Renfrew, 1978) y en el norte de
Israel se descubrió un gran almacenaje de lentejas, estableciéndose como fecha
probable el 6800 AC.
El
género Lens es un miembro de la tribu Vicieae la cual incluye, además de la
lenteja, a la mayoría de las legumbres de la civilización Mediterránea tales
como haba y arveja. El límite genético preciso entre Lens y los demás géneros
incluidos en Viciaea (Vicia; Lathyrus; Pisum y Vavilovia) han sido muy
debatidos, pero Lens se relaciona de manera más estrecha con el género Vicia (Kupicha,
1981).
En base a caracteres morfológicos, incluyendo el polen y pistilo, caracteres
bioquímicos y cruzamientos intra e interespecíficos, se determinó que el género
Lens está constituido por siete taxones con seis especies (Ferguson
et al., 1998;
Ferguson, 2000; Fratini et al., 2011). El taxón
cultivado, Lens culinaris Medik. subsp. culinaris y la subespecie orientalis
pertenecen al pool génico primario, mientras que L. odemensis y L. tomentosus
fueron asignados al pool génico secundario, aunque, el éxito en los
cruzamientos con la especie cultivada pueden requerir rescate de embriones. L.
lamottei, L. nigricans y L. ervoides pertenecen al pool génico terciario, pero
podrían formar parte del pool génico secundario mediante el rescate de
embriones (Fratini et al., 2011). Lens culinaris subsp. culinaris es originaria
del cercano oriente y centro de Asia. La domesticación probablemente comenzó
con la selección de plantas de especies silvestres que retenían sus semillas en
las vainas antes de cosecharlas y luego se continuó seleccionando para tamaño
de semilla grande. La lenteja, al ser una especie autógama, podría haber
ayudado mayormente a mantener identificadas las líneas en el proceso de
domesticación (Sandhu y Singh, 2007).
Barulina (1930) agrupó a la lenteja
cultivada en 2 subespecies en base a un conjunto de caracteres cualitativos y
cuantitativos relacionados: -subsp. macrosperma (Baumg.) Barul., la cual se
caracteriza por vainas grandes, generalmente planas, con semillas planas de
gran tamaño (>4,5 mm de diámetro) (Fratini y Pérez de la
Vega, 2011).
Los cotiledones normalmente son de color amarillo y se presenta una escasa o
ausencia de pigmentación en flores o estructuras vegetativas (Muehlbauer
et al., 2002).
Los sépalos son largos, los folíolos son grandes y ovales. La altura de planta
oscila entre los 25 y 75 cm y son generalmente encontradas en la zona Mediterránea,
África y Asia menor. -subsp. microsperma (Baumg.) Barul. caracterizada por
vainas pequeñas a mediana las cuales son convexas.
Figura 1. Lenteja tipo Macrosperma.
Figura 2. Lenteja tipo Microsperma.
Las
semillas son subglobosas pequeñas (<4,5 mm de diámetro) (Fratini
y Pérez de la Vega, 2011). Las flores son pequeñas, de colores que pueden variar
del blanco al violeta o azul con patrones diversos. Los cotiledones pueden ser
naranjas, rojos o amarillos (Muehlbauer et al.,
2002).
La altura de planta varía entre 15 a 35 cm y se caracterizan por ser más
pigmentadas y con folíolos más pequeños. Son encontradas generalmente en el
subcontinente Indio y en el Cercano oriente (Muehlbauer et al., 2002). Además,
se ha demostrado que estos dos grupos difieren en la pubescencia de hojas,
tallos y vainas, en los días a floración y madurez (Sharma,
2011)
y en la resistencia a ciertos patógenos (Fratini y Pérez de la Vega, 2011).
CALIDAD DE SEMILLA
Desde
el punto de vista nutricional posee un alto valor proteico (20-30%), alto
contenido de carbohidratos (43-70%) y es una fuente rica en fibra dietética,
antioxidantes, vitaminas y minerales esenciales en la dieta (Kumar
et al., 2018)
aunque afectada su composición por factores genéticos y ambientales (Erskine
y Sarker, 2004).
Wang
et al. (2008)
mostraron variabilidad entre genotipos para el contenido de proteínas (24,3% a
30,2%), mientras que Palacios et al. (2020) mostraron valores
fluctuantes entre 22 y 34,5%. Presentan un contenido de almidón variable de 35
a 63%, ceniza y fibra dietética soluble (Urbano et al., 2007). Otro factor de la
calidad del grano es la presencia de taninos que al oxidarse causa el
oscurecimiento de la semilla (Matus et al., 1993) y es un efecto
comercial detrimental. Para el procesamiento de semilla (remojo, cocción y
descascarado), Ninou et al. (2019), mostraron la
presencia de variabilidad genética. La calidad de cocción, asociada con la
facilidad, tiempo de cocción y costo de preparación de alimentos, es un
determinante para el uso de la lenteja como alimento (Joshi
et al., 2017).
PRODUCCIÓN MUNDIAL Y NACIONAL
La
producción mundial se ubicó en el 2017 en las 7.6 millones de toneladas, con
6.5 millones de hectáreas dedicadas al cultivo. El principal productor mundial
es Canadá, seguido por India y en menor escala por EE.UU. y Turquía. En el
mercado internacional se colocan anualmente 3 Mt, siendo el principal
exportador Canadá seguido por los Estados Unidos y Australia. En la importación
destacan India, con un cuarto de la demanda mundial, Turquía y Bangladésh
(Ruralnet, 2020).
En
Argentina, la principal región productora se ubica al sur de Santa Fe
(Departamentos de Caseros, Constitución, Rosario y San Lorenzo) y al norte de
Buenos Aires (Partidos de Pergamino, Rojas y Salto). Aquí el cultivo se hace en
forma extensiva, de secano y durante el invierno, y luego de la cosecha, se
realiza la siembra de soja de segunda. Una segunda zona de producción, aunque
de menor envergadura, es la constituida por las provincias del noroeste,
principalmente Jujuy y Salta. En estas provincias el cultivo se hace bajo riego
y es de superior calidad, debido a una mayor sanidad. Según estimaciones de la
Secretaría de Agroindustria, el consumo de lentejas explica el 50% del consumo
de legumbres en nuestro país. Se estima que en la campaña 2018/19 se produjeron
18.000 toneladas. Entre los destinos principales de las exportaciones destacan
España, Uruguay y Brasil, quienes representan tres cuartas partes de las
exportaciones del país (Ruralnet, 2020).
Figura 3. Porcentajes de área de los diferentes
cultivos invernales en el sudeste de Santa Fe y nordeste de Buenos Aires, año
2017.
La
lenteja presenta un panorama alentador en cuanto a su producción, debido
principalmente a sus bajos costos de cultivo y la posibilidad de reemplazar al
trigo en la rotación con soja, incorporando nitrógeno al suelo a través la
fijación simbiótica y favoreciendo una agricultura más sustentable.
MEJORAMIENTO GENÉTICO
El
principal problema para los productores es la falta de cultivares, ya que solo
se utiliza una única variedad comercial denominada Silvina originada en la EEA
INTA San Pedro. Para solucionar este inconveniente, un programa de mejoramiento
se lleva a cabo en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional
de Rosario, con el objetivo de obtener nuevos cultivares con mayor rendimiento
e idoneidad para los diferentes mercados de exportación. El primer paso de
pre-breeding consistió en introducir desde el ICARDA (International Center for
Agricultural Research in the Dry Areas) y desde el USDA (United States
Department of Agriculture) una colección de germoplasma, evaluando la
variabilidad disponible utilizando características de importancia agronómica.
La caracterización se realizó mediante caracteres con alta heredabilidad y la
evaluación por medio de caracteres de baja heredabilidad y así determinar la
utilización de este germoplasma.
Bermejo et al.
(2012 b) realizaron
evaluaciones preliminares que demostraron la presencia de una elevada
variabilidad fenotípica entre las variedades de lenteja para diferentes
características de importancia agronómica, mostrando a la vez la presencia de
materiales experimentales con un gran potencial para ser utilizados como nuevas
variedades comerciales o como progenitores en cruzas para la generación de
nueva variabilidad. Se comenzaron programas paralelos de mejora para la
obtención de nuevas variedades tanto de tipo macrosperma como microsperma.
Para
el tipo macrosperma, se efectuó la cruza entre materiales selectos (LC960090 X
ILL8072), de la cual derivó una población F2 que fue implantada en el año 2004.
Esta población fue sometida a un proceso de selección masal durante seis
ciclos. Posteriormente, al alcanzarse el nivel de homocigosis deseado se
procedió a seleccionar plantas individuales en función de la fecha de floración
y características del grano y porte de la planta para la multiplicación de
semillas y su posterior evaluación en parcelas con repeticiones a campo por
caracteres morfo-vegetativos y productivos por tres ciclos consecutivos. De
esta última selección surgió la variedad Boyerito FCA que presenta un excelente
rendimiento, ciclo precoz y buen tamaño de grano con cotiledones amarillos.
Figura 4. Semillas del cultivar Boyerito FCA.
Cultivar de grano marrón claro, de tegumento liso, cotiledones amarillos,
diámetro medio de semilla de 6,5 mm. Su ciclo es de 83 días a floración, con
flor blanca y un buen potencial de rendimiento.
Figura 5. Semillas del cultivar Tacuarita FCA.
Cultivar de grano marrón oscuro, de tegumento moteado, cotiledones rojos.
Diámetro promedio de semilla de 4,5 mm. 102 días a floración. Altura de planta
de 25-30 cm. Flor blanca y excelente rendimiento, superior al tipo macrosperma.
Para
el tipo microsperma, se obtuvo una población F2 proveniente de la cruza de las
líneas experimentales ILL005 x ILL8008 que fue sometida al mismo proceso
detallado con anterioridad para la variedad Boyerito FCA. La variedad Tacuarita
FCA presenta un excelente rendimiento, ciclo precoz y es la primera en su tipo
al poseer granos con cotiledones naranjas.
HERRAMIENTAS AUXILIARES DE LOS PLANES DE MEJORA
Uso de marcadores moleculares
La
diferenciación entre líneas experimentales seleccionadas generalmente se basa
en rasgos morfológicos y/o productivos, pero estos rasgos pueden verse
afectados por las condiciones ambientales en las que se cultiva (condiciones
del suelo, deficiencia de nutrientes, estrés hídrico, temperatura extrema,
infestación de plagas, operaciones de manipulación) (Tullu
et al., 2008;
Roy
et al., 2013).
Estos hechos hacen que los usos de caracteres ligados a la producción sean
inadecuados para identificar diferentes genotipos. Bermejo et al. (2014) evaluaron la
variabilidad presente en un conjunto de líneas experimentales obtenidas por
selección masal en nuestro programa de mejoramiento utilizando rasgos
morfológicos y marcadores SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism) (Li
y Quirós, 2001)
y SSR (Simple Sequence Repeat) demostrando que el uso de marcadores moleculares
en conjunto con rasgos productivos es una mejor manera de lograr una
diferenciación completa entre líneas. Por otra parte, encontraron dos
fragmentos exclusivos de SRAP en el grupo microsperma, lo que permite la
selección temprana de este rasgo y todos los caracteres asociados con él.
Cultivo in vitro
Un
enfoque alternativo para la mejora de este cultivo es la complementación de los
métodos tradicionales de mejora con técnicas biotecnológicas. La transgénesis
ha sido difícil y desafiante debido a su naturaleza recalcitrante a la
regeneración in vitro (Gulati y Mc Hughen, 2003) por lo cual el
establecimiento de un sistema de multiplicación in vitro eficiente y repetible
es uno de los requisitos previos básicos para la transformación (Omran
et al., 2008).
Bermejo
et al. (2012a)
desarrollaron un eficiente protocolo de regeneración in vitro de bajo costo,
basado en explantes de nudos cotiledonales en posición invertida y sobre medio
de cultivo con reguladores vegetales que puede ser utilizado para la
transgénesis de esta especie.
Figura 6. Regeneración de plantas de lentejas a
partir de nódulos cotiledonales cultivados en orientación invertida (extremo
apical en el medio). A y B) Desarrollo del brote del nudo cotiledonal después
de 8 días y 20 días de cultivo, respectivamente; C) Enraizamiento in vitro de
explantes de nudos cotiledonales después de dos meses de cultivo, (D)
Enraizamiento in vitro-in vivo de los brotes cortados, con raíces (r) que
sobresalen después de seis días de cultivo en medio IVS. (E) Aclimatación de
plantas enraizadas que muestran fenotipo normal con vainas normales (p) después
de dos meses en medio IVS.
Transgénesis
Un
enfoque alternativo para la mejora de este cultivo es complementar los métodos
tradicionales de mejora con técnicas biotecnológicas como la transgénesis. Bermejo
et al. (2019)
establecieron un protocolo de transformación mediado por Agrobacterium
sencillo, barato y con una frecuencia de transformación del 7% que es la más
elevada obtenida hasta el momento. Este protocolo es compatible con un
protocolo de regeneración in vitro optimizado a partir de nudos cotiledonales.
Figura 7. Efecto de la kanamicina (Kan) sobre la
regeneración de tallos y raíces en los explantes de nudos cotiledonales. A)
Tallos cloróticos regenerados a partir de explantes con 100 mg L-1 de
kanamicina a los 7 d de cultivo; B) Tallos verdes regenerados a partir de
explantes cultivados en medio sin kanamicina a los 7 d de cultivo; C-G) Número
de tallos regenerados por nudo cotiledonal después de 17 d de cultivo; H)
Enraizamiento in vitro a partir de explantes cultivados en medio con 25 y 50 mg
L-1 de kanamicina y luego subcultivados en medio con 25 y 50 mg L-1 de
kanamicina respectivamente; I) Pérdida de la capacidad de enraizamiento in
vitro de explantes cultivados en medio M1 con 70 y 100 mg L-1 de kanamicina y
luego subcultivados en medio sin kanamicina. (bar 1 cm).
Figura 8. Análisis de plantas transgénicas putativas.
A) Análisis por PCR para confirmar la presencia del gen npt-II en los tallos
regenerados a partir de 14 explantes transformados a partir de nudos
cotiledonales.
El
fragmento amplificado de 700 pb (marcado con una flecha) se detectó en los 14
transformantes (líneas 1-14). Líneas 15, 16, testigos positivos provenientes de
2 colonias distintas de la cepa GV2260 de Agrobacterium tumefaciens
transformadas con el plásmido pBI121; líneas 17, 18, plantas no transformadas
(testigos negativos); línea 19, testigo negativo de la PCR (agua); M, marcador
de peso molecular 100-pb. B) Prueba histoquímica de GUS en lenteja. 1-7,
Expresión de GUS en tejidos distintos de hojas de siete explantes de nudos
cotiledonales potencialmente transformados demostrados por la aparición de
color azul índigo. C) hoja de lenteja proveniente de una planta testigo no
transformada.
Fenotipado digital
Al
igual que en el cultivo de arveja el fenotipado digital demostró ser una
herramienta poderosa para la caracterización de germoplasma junto con la
evaluación de campo de rasgos agronómicos. Espósito et al. (2020) evaluaron la
variabilidad genética de una colección activa mediante características
agronómicas y características de semillas (tamaño y color) usando fenotipado
digital, que es una metodología no destructiva, automatizada y basada en
imágenes que ofrece una estimación de la morfología de la semilla y estima
parámetros como color y tamaño para la selección de accesiones para uso
comercial o como padres en el programa de mejora.
Aceleración de generaciones
La
mejora en lentejas implica un proceso de hibridación seguido de diferentes
métodos de selección, requiriéndose 10 años para obtener un nuevo cultivar ya
que sólo es posible una generación de campo por año. Hace unos años, la
duración del ciclo de generación se ha reducido utilizando una estrategia solo
in vitro (Mobini et al., 2014) y una estrategia
solo in vivo (Croser et al., 2014). Sin embargo, no
había información para acelerar procesos de mejora en lentejas utilizando un
método in vitro más in vivo combinado con un método SSD. Bermejo
et al. (2016)
desarrollaron un sistema eficiente in vitroin vivo estableciendo el mejor
momento para extraer embriones inmaduros y el mejor medio de cultivo para
obtener un completo desarrollo de plantas tanto en lentejas de tipo macrosperma
como microsperma. Todas las plantas obtenidas fueron morfológicamente normales
y fértiles. Usando esta metodología se pueden obtener cuatro generaciones por
año.
Speed Breeding para la multiplicación de colecciones
activas en lenteja
Las
semillas en las colecciones activas deben mantenerse en cantidad y calidad
suficiente con el fin de estar disponibles cada vez que sean necesarias. La
multiplicación en campo suele estar condicionada por las condiciones
ambientales en cuanto al clima y a la presencia de plagas, por lo que es
indispensable contar con un sistema de regeneración que no se vea afectado por
condiciones impredecibles. Maglia et al. (2020) demostraron la utilidad
de esta metodología de aceleración de generaciones para su implementación en
los bancos de germoplasma ya que se logran 5-6 generaciones/año.
Figura 9. Sistema in vitro-in vivo. a) Momento de
antesis y fertilización; b) Vainas cosechadas a los 15, 18, 21 y 24 días
después polinización (DAP) que contiene semillas inmaduras; c) Cultivo in vitro
de semillas inmaduras de 18 DAP (cuatro semillas inmaduras por tubo de vidrio);
d) Germinación in vitro de semillas inmaduras produciendo brotes y raíces; e)
Plantas cultivadas en invernadero hasta floración.
Figura 10. Plantas de lenteja en cámara de crecimiento
y medio hidropónico.
ANÁLISIS QUÍMICOS PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS DE
SEMILLAS
Palacios et al. (2020) evaluaron la
concentración y composición proteica de 7 genotipos (3 macro, 4 micro) élite
del programa de mejora y su relación con el peso de semillas. Los análisis de
correlación indicaron la ausencia de correlación entre contenido proteico y
peso de semilla. Realizaron un SDS-PAGE cuyo patrón contuvo bandas
correspondientes a vicilinas (53, 48, 43 kDa), convicilina (70 kDa), leguminas
(23, 22, 20 kDa), lectina (32 kDa) y dos globulinas, ácida y básica (37 y 25
kDa, respectivamente). A partir de este estudio se identificaron líneas
microspermas superiores en contenido proteico al testigo comercial Silvina
pudiendo ser explotadas en la industria o en programas de mejora de calidad de
lenteja.
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